4.4 Drylab中的单细胞RNA测序（scRNA-seq）工作流程

GSE162631（胶质母细胞瘤单细胞 RNA 测序，scRNA-seq）的完整操作流程——从原始 10x 计数到已注释的细胞群（clusters）——并附带每一步所使用的确切提示词（prompts）。

第一阶段：准备工作
在运行任何程序之前，先找到合适的工作流并进行妥善的简报。

1. 寻找工作流：搜索 @scrna

在新对话中输入 @scrna。Drylab 将筛选出四个单细胞工作流：scRNA Cell-Type Annotation（单细胞 RNA 细胞类型注释）、scRNA-seq GEO Curation（单细胞 RNA 测序 GEO 数据整理）、scRNA QC + Clustering（单细胞 RNA 质控与聚类）、Spatial Domain Detection & Annotation（空间域检测与注释）。本指南将首先使用 scRNA QC + Clustering，随后再链接到 scRNA Cell-Type Annotation 工作流。

2. 预览工作流：阅读带编号的步骤及其标签

在选择之前，先滚动浏览资源预览。scRNA QC + Clustering 包含六个步骤：(1) 加载数据并计算质控（QC）指标，(2) 设置质控阈值（自定义），(3) 检测并去除双细胞（Single Choice，单选），(4) 归一化、选择高变基因（HVG）并进行降维嵌入（Gating Tree，门控树），(5) 选择聚类分辨率（Image Choice，图片选择），(6) 导出经质控和聚类处理的对象。这六个步骤中有三个会暂停以等待您的输入，标签会提示您是哪几个步骤以及如何交互。

3. 阅读文档和所使用的技能

文档确认了这是正确的工作流：“针对原始 scRNA-seq 数据进行逐步质控和聚类：计算每个细胞的质控指标，通过实时细胞保留率（%）反馈交互式设置 nGenes/UMI/线粒体基因（mito）截断值，去除双细胞，进行归一化和降维嵌入，然后从备选的 UMAP 图中选择聚类分辨率。”所使用的技能（Skills Used）列出了 Single Cell scRNA Quality Control（单细胞 RNA 质控）和 Single Cell scRNA Embedding Clustering（单细胞 RNA 降维嵌入与聚类）。

4. 设置您的审核模式

如果您是首次在该数据集上运行质控（QC）和聚类（Clustering），请将步骤审核（Step review）设置为 Every step（每一步），这样您就能看到发生的每一个检查点。在验证过阈值并重新运行程序时，您可以将其放宽至 Auto（自动）。

第二阶段：质控与聚类
启动任务，然后随着 Drylab 呈现各个检查点，逐一完成。

1. 使用设定了完整参数的提示词启动任务

这是用于启动本指南操作的实际提示词——使用了 @scRNA QC + Clustering，随后紧跟 Drylab 所需的所有详细参数：

请注意，它指明了每一个工具（Read10X、scDblFinder、NormalizeData、RPCA、Harmony）、每一个阈值（线粒体占比 >10%、基因数 <200、分辨率 0.4–1.2）以及每一个元数据字段（patient_id、region）——没有留下任何让 Drylab 凭空猜测的空间。

2. 审核生成的运行计划

Drylab 将提示词转化为七个具名的步骤——从“读取所有八个样本、标记患者和区域并检查数据质量”一直到“保存完成聚类的数据集、代码和总结表”。请仔细阅读每一步，如果发现问题，在运行计算之前，您可以在此编辑或删除步骤。

3. 批准——或接受推荐配置并批准

滚动到计划的底部，在您批准之前，Drylab 可能会提示资源方面的顾虑——此处提示“建议增加内存”，因为在同一个会话中同时运行 RPCA 和 Harmony 整合分析是非常消耗内存的。“Approve Plan”（批准计划）将按指定配置运行；“Approve with [suggestion]”（接受建议并批准）则会采用升级后的实例规格。

4. 回答整合方法澄清问题

在运行中途，Drylab 遇到了一个真正的抉择点：提示词要求同时使用 RPCA 和 Harmony 来比较批次效应的混合情况，但并未说明应基于哪种方法的结果进行后续聚类。它解释了折中方案并提供了四个选项。在这里，选择了“在两者上均进行聚类，并直接提供两张‘细胞群-样本’（cluster-by-sample）对照表”——从而获得直接的对比，而不是盲目相信 Drylab 的默认推荐。

5. 利用实时证据拖动质控（QC）阈值

交互式质控检查点会预填您要求的默认值（200 个基因，10% 的线粒体基因），并立即显示其产生的结果：在此默认值下，在 4,999 个细胞的分层抽样中保留了 82.4%，推算到全部 120,279 个细胞中大约保留 99,082 个。在确认之前，可以拖动任意滑块实时查看数值的变化——无需重新运行即可获知结果。

6. 对比 RPCA 与 Harmony，并直观选择分辨率

聚类参数扫描对这两种降维嵌入方法分别运行了五个分辨率（RPCA 产生 17-33 个细胞群；Harmony 产生 15-29 个细胞群）。Drylab 推荐使用 harmony_res_0.8（包含 24 个细胞群，其中仅有 1 个纯批次细胞群，是所有选项中最少的），并展示了每个备选的 UMAP 图，且在下方标明了其因批次效应导致的细胞群数量，以便您可以核实推荐结果，而非盲信。

7. 在继续下一步之前检查溯源表

完成的步骤会精确报告所生成的产物：主 .rds 对象（活动身份为 rpca_res_0.8，保留了两种方法的聚类列）、一个可由 Python 读取的 .h5ad 副本、19 张图表、12 张表格，以及一个记录了区域映射确认信息、每个参数和全程使用 set.seed(42) 的 README 文件。这就是您要移交给合作者，或是在六个月后需要核对的文件。

第三阶段：细胞类型注释
直接链入标注流程，使用您刚刚构建的聚类对象。

1. 链入带您自定义标记物（markers）的细胞类型注释流程

在同一个对话中，标记下一个工作流，并提供经典的特征标记物（canonical markers），而不是接受通用的默认标记物——以下是实际使用的提示词：

该标记物面板是专门针对这种肿瘤微环境（内皮细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、T/B 细胞、树突状细胞、壁细胞）设计的。您可以将标记物集换成您自己组织专属的标记物——其工作流结构（FindAllMarkers → 气泡图 dot plot → 标注 label → cell_type 列）保持不变。

2. 对照标记物证据确认细胞类型标签

“细胞类型注释”（Cell-Type Annotation）自身的文档设定了预期目标：“从备选的 UMAP 图中选择聚类分辨率，对照标记物证据确认每个细胞群的标签，决定对哪些混合细胞群进行亚群聚类（subclustering），解决含糊/低置信度的判定，并导出带有溯源追踪的已注释对象。”步骤 3“运行初步注释”（Run primary annotation）被标记为 Table Edit（表格编辑）——您将看到针对每个细胞群生成的标签，并可以纠正任何与您的标记物面板不符的标签。

3. 决定是否对混合细胞群体进行亚群聚类

步骤 4 是明确可选的，并被标记为 Single Choice（单选）：如果某个细胞群显示出混合的标记物信号（例如，同时存在巨噬细胞和小胶质细胞的标记物），您可以决定是将其进一步细分，还是将其作为一个群体接受。任何亚群聚类都不会在后台默默进行——该选项会呈现出来并等待您的决策。