本应用案例由学术研究人员与 Drylab 共同创建。完整的对话过程展示了研究人员如何与 Drylab 进行交互以执行分析、提出问题，并随着新见解的涌现而调整工作流程。
我们希望这些示例能为您自己的研究带来新的方法和启示。
摘要
分析荧光显微镜图像，以自动分割巨噬细胞，在单细胞水平上量化 CD11b 表达，测量细胞覆盖度，并对不同实验条件下的细胞进行计数。该工作流针对不规则的变形虫样巨噬细胞形态和密集排布的细胞群体进行了优化。
输入
荧光显微镜图像
DAPI 通道（细胞核）
CD11b/APC 通道（巨噬细胞标记物）
可选的合并图像
输出
单细胞分割掩膜
细胞形态学测量（面积、离心率、紧实度）
每张图像的细胞计数
细胞覆盖面积（占图像面积的百分比）
每个细胞的平均 CD11b 强度
不同条件下的统计学比较
分析细分
数据集：BBBC020（Broad 生物图像基准收集库）— 包含 25 张骨髓来源巨噬细胞在 6 个时间点条件下的荧光显微镜图像（Kontrolle n=3, 15min n=5, 30min n=5, 1h n=5, 2h n=2, 24h n=5）。
每个样本提供三个配准的 RGB TIFF 文件：_c1（CD11b/APC — R 通道中的信号）、_c5（DAPI — B 通道中的信号）以及 _(c1+c5)（合成图）。图像分辨率为 1040×1388 像素，uint8 格式。
通道分配已确认：CD11b/APC 在 R 通道中占主导地位（p99 = 186），DAPI 在 B 通道中占主导地位（p99 = 154），通道间无串扰。通道概览如下图所示。
图像分割
将 Cellpose cpsam 模型（v4.0.1+，cyto3 的后续版本，在约 7 万张图像上进行了预训练）应用于原始 CD11b/APC R 通道（灰度，channels=[0,0]，flow_threshold=0.4，cellprob_threshold=0.0，diameter=None — 每张图像自动估算）。经验细胞直径是在分割后从每个掩膜中以 2 × sqrt(mean_area / π) 计算得出的。
所有 25 张图像均成功分割；整个数据集中共检测到 1,154 个细胞（平均每张图像 46 个细胞）。
在所有样本中，面积变异系数范围为 0.48–0.91 — 均远低于 1.5 的重新分割触发阈值，证实了掩膜质量的统一性。
经验细胞直径：116–172 像素，与不同条件下大型变形虫样巨噬细胞的形态一致。
定性叠加检查证实了精确的边界描绘，包括在密集的 1h/2h 视野中。
细胞计数
Kontrolle：30–36 个细胞/图像（平均约 34 个）；在 1h 时上升至 44–76 个细胞/图像（平均约 55 个），在 2h 时上升至 64–71 个细胞/图像（平均约 68 个）；在 24h 时部分下降（29–49 个，平均约 41 个）
面积覆盖度
对照组 (Controls)：覆盖 23–36% 的图像面积
在 1h–2h 时达到约 60–67% 的峰值；24h 的范围为 29–65%（高变异性）。
单个细胞的 CD11b 平均强度
在所有 25 张图像中，单个细胞 CD11b 强度的中位数范围为 43–92
a.u.，在不同条件之间没有表现出明显的方向性趋势。
不同条件下的统计学分析
Kruskal-Wallis 综合检验
终点 | H | p | 显著性 |
|---|---|---|---|
细胞计数 | 13.82 | 0.017 | * |
覆盖面积比例 | 7.38 | 0.194 | ns |
平均 CD11b 强度 ( | 7.99 | 0.157 | ns |
细胞计数是唯一在综合水平上达到统计学显著性的终点（H = 13.82，p = 0.017）。
覆盖面积比例（H = 7.38，p = 0.194）和单个细胞的平均 CD11b 强度（H = 7.99，p = 0.157）均无显著性差异。
Dunn's 事后检验（经 Bonferroni 校正的两两比较）
在任何终点中，没有一个单独的两两比较在经过 Bonferroni 校正后仍具有显著性。细胞计数中 p 值最低的两组对为：
组 1 | 组 2 | p (Bonferroni) |
|---|---|---|
Kontrolle | 2h | 0.094 |
Kontrolle | 1h | 0.158 |
30min | 2h | 0.168 |
校正后，所有其余的比较均降为 p = 1.000。
细胞计数是在六个时间点上唯一具有可检测到的统计学综合效应的终点。原始数据显示出清晰的方向性趋势：平均细胞计数从约 34 个（Kontrolle）上升到 1h-2h 时的约 55-68 个，然后在 24h 时部分恢复至约 41 个。然而，这种时间格局在经过 Bonferroni 校正的两两检验中并未保留下来，这在每个组的重复样本数较少（n = 2-5）的情况下是预料之中的：保守的惩罚在这种样本深度下抵消了生物学上合理的效应量。这与巨噬细胞招募动力学一致，在早期时间点，细胞流入会被反映出来，而此时单个细胞激活状态的变化尚未能被检测到。
2h 条件在细胞计数（每张图像约 67-71 个细胞）和面积覆盖度（约 60%）两方面均带有最显著的表观峰值；然而，由于仅有 n = 2 个重复，这一表观峰值的统计效能严重不足，必须将其视为探索性结果，而非确认性结果。
面积覆盖度和单个细胞的 CD11b 强度在不同条件之间未显示出统计学上的显著差异，这意味着 CD11b 信号随时间的总体增加主要是群体数量效应——即积聚了更多的细胞——而不是单个细胞在转录或翻译水平上对 CD11b 的上调。
后续步骤
在 2h 条件下增加重复样本数（最好是将所有条件的重复数增加至 n ≥ 5），以提供足够的统计效能进行经过 Bonferroni 校正的两两检验。在当前的 n 值下，基于假阳性率（FDR）的校正（Benjamini-Hochberg）将不那么保守，并可能会显示出显著差异的组对——可考虑将其应用于敏感性分析中。
趋势分析：鉴于细胞计数具有明显的方向性增加趋势，在有序时间点上进行非参数趋势检验（例如 Jonckheere-Terpstra 检验），将比详尽的两两比较在统计学上更有效率。
单个细胞的 CD11b 分析：考虑检验完整的单个细胞分布（使用
percell_all.csv，共 1,154 个细胞），而不是每张图像的平均值，这将大大增加检测强度变化的统计效能。
