数据集概述
数据集：Bend3 和 mLSEC 流式细胞仪数据
该数据集由四个流式细胞仪 (.fcs) 文件组成，代表两个细胞系 Bend3 和 mLSEC，在染色和未染色条件下。分析解析这些文件以使用 BV510 (Aqua Zombie) 通道评估细胞活性，通过基于未染色对照建立的门限来区分活细胞和死细胞以及自发荧光。
活细胞门限和活性评估
分析从评估 Bend3 和 mLSEC 内皮细胞系的细胞活性开始。使用 Aqua Zombie 活性染料 (BV510-A 通道) 进行活/死鉴别。为了考虑细胞自发荧光，特别是在 Bend3 系中，使用未染色对照 (BV510-A < 2,826) 建立了门限。
两个细胞系均显示出卓越的活性 (>99%)，表明样品准备质量高。 Bend3 细胞在紫色光谱中表现出显著的自发荧光肩部，但通过基于对照的门限方法成功地排除在死细胞门限之外。下面的 FSC-A 与 BV510-A 散点图展示了主要活细胞群（蓝色/低密度）与极少数死细胞群之间的清晰分离。
内皮表型特征
在活细胞门限之后，使用 CD31 (PECAM-1) 和 CD146 (MCAM) 对内皮表型进行了特征分析。使用未染色对照（第99百分位 + 20% 边距）设置了细胞类型特异性门限。
Bend3 细胞表现出强有力的经典内皮表型，75.88% CD31+ 和 95.05% CD146+ 形成了明显的双阳性群体。相比之下，mLSEC 细胞表现出不同的表型：虽然它们保持高 CD146 表达 (76.02%)，但几乎没有 CD31 表达 (0.86%)。这可能表明 mLSEC 培养中存在显著的表型漂移或特定的亚表型。
ACKR1 表面表达分析
在活内皮细胞群体中分析了非典型趋化因子受体 1 (ACKR1) 的表达。分析揭示了两种细胞系之间的显著差异。 Bend3 细胞表现出广泛的 ACKR1 表达，约 53% 的群体与内皮标记物共同表达 ACKR1。相反，mLSEC 细胞主要为 ACKR1 阴性 (<3%)。
为了避免潜在的光谱伪影（在后续部分讨论），下面的主要可视化使用 CD31 (FITC) 和 ACKR1 (PE)，因为这些通道的光谱重叠最小。这证实了 Bend3 细胞的 ACKR1 信号是真实的而不是技术伪影。
细胞类型 | ACKR1+/CD31+（活细胞的百分比） | ACKR1+/CD146+（活细胞的百分比） |
|---|---|---|
Bend3 | 53.28% (18,983 个细胞) | 53.41% (19,028 个细胞) |
mLSEC | 0.70% (106 个细胞) | 2.65% (399 个细胞) |
技术验证：光谱溢出评估
在 ACKR1 (PE 通道) 与 CD146 (PE-Cy7 通道) 分析过程中，在染色的 Bend3 样本中观察到与未染色对照相比的强相关性 (r = 0.809)。这种“彗星尾效应”表明来自明亮的 CD146 信号对 ACKR1 探测器的显著光谱溢出。
为了验证上一部分报告的 ACKR1 阳性是生物学上的而非纯技术上的，生成了分层直方图。这些图解耦通道并显示即使在 CD146+ 群体中，Bend3 细胞也呈现出双峰 ACKR1 分布 (56.2% 阳性)，而 mLSEC CD146+ 细胞保持阴性。这确认了 Bend3 细胞中存在真实的 ACKR1+ 群体，尽管有溢出伪影。
附录
此附录包含分析笔记本中的代码单元及其输出。